Résumé
Lors de l'assemblage et du bourgeonnement du VIH, la membrane plasmique subit une courbure entraînée par l'auto-assemblage du VIH-1 Gag au site d'assemblage vers l'extérieur de la cellule. Cependant, la multimérisation de Gag peut ne pas être suffisante et Gag peut avoir besoin de recruter des facteurs cellulaires pour induire une courbure de membrane locale. Nous avons récemment rapporté que la libération de particules de VIH-1 Gag dépendait de l'activation de la voie de signalisation Rac1 / IRSp53 / Wave2 / Arp3 dans les cellules Jurkat T et les lymphocytes sanguins primaires. Ce complexe cellulaire, lorsqu'il est activé, est recruté dans la membrane plasmique cellulaire et favorise le recrutement de la ramification de l'actine, la polymérisation de l'actine et le remodelage de la membrane dans les lamellipodes. En particulier, la protéine IRSp53 contient un domaine I-BAR capable d'induire une courbure membranaire via la reconnaissance du phospholipide de membrane plasmique PI (4,5) P2. Ce phospholipide est également spécifiquement reconnu par le domaine Matrix N-terminal de Gag et est un cofacteur lipidique du ciblage de Gag vers la membrane plasmique et de l'assemblage du VIH-1. Ce projet de recherche visait à caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'implication de l'IRSp53 dans l'assemblage du VIH-1 dans les cellules T CD4 et HEK293T. Nos résultats montrent que l'IRSp53 est associé à des particules virales et que son renversement par l'ARNsi diminue la libération du VIH-1 dans les lymphocytes T et les cellules T HEK293. La microscopie électronique des cellules renversées pour IRSp53 a révélé un phénotype frappant de bourgeons viraux arrêtés à un stade précoce de l'assemblage. L'immunoprécipitation de l'IRSp53 a montré une conversion indépendante de p6 de HIV-1 Gag, indiquant une complexation intracellulaire de Gag et de l'IRSp53. Le fractionnement cellulaire et la flottation de la membrane ont montré que le recrutement de l'IRSp53 vers la membrane cellulaire double lors de l'expression du VIH-1 Gag. La microscopie PALM / STORM à molécule unique bicolore et les analyses ultérieures ont montré l'IRSp53 à proximité des amas Gag. Nous avons également trouvé une incorporation spécifique de l'IRSp53 dans les particules de VIH-1 Gag par rapport à d'autres protéines I-BAR, un phénomène dépendant de son domaine I-BAR. Comme le domaine I-BAR est impliqué dans la courbure de la membrane, nous avons ensuite sondé cet aspect de l'implication de l'IRSp53 dans l'assemblage du VIH-1. L'analyse des images de microscopie électronique a révélé un défaut de courbure pour les bourgeons des cellules assommées IRSp53. Des études concomitantes dans des systèmes GUV in vitro sans cellule ont également indiqué un rôle pour la courbure de la membrane induite par IRSp53 dans la liaison à la membrane Gag. Ces résultats confirment le rôle essentiel de l'IRSp53 dans les premiers stades de l'assemblage du VIH-1. Enfin, comme l'IRSp53 est un acteur essentiel dans l'échafaudage des protéines de signalisation de l'actine, nous avons établi un rôle pour le Rac1 activé dans le recrutement de la membrane IRSp53 en aval du VIH-1 Gag, et testé l'implication du RacGEF Tiam1 dans la production de particules du VIH-1. La microscopie à super résolution révèle également la présence de nanostructures d'actine sur les sites d'assemblage du VIH-1. Tous ces résultats mettent en évidence le rôle nouveau et essentiel de la protéine I-BAR à courbure membranaire IRSp53, et la mobilisation de l'actine corticale, dans les phases tardives de la réplication du VIH-1.