Résumé
Les anticorps monoclonaux (mAbs) constituent une classe importante des médicaments de biothérapie ciblée. De par leur mode de production, les mAbs présentent diverses micro-hétérogénéités qui peuvent affecter leurs propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. Par conséquent, des investigations/contrôles de leurs propriétés physicochimiques et fonctionnelles sont nécessaires pour évaluer leur qualité, efficacité et sécurité. A cette fin, l’électrophorèse capillaire (EC) présente plusieurs avantages dont la miniaturisation et les hautes efficacités de séparation. De plus, l’absence de phase stationnaire en EC permet l’utilisation du capillaire de séparation comme microréacteur enzymatique préalablement à l’étape d’analyse électrophorétique (séparation + détection).Les travaux rapportés dans cette thèse ont porté sur le développement de méthodologies analytiques originales pour le contrôle de mAbs thérapeutiques utilisant l’EC en tant que microréacteur enzymatique et support de séparation, couplée à une détection UV ou spectrométrie de masse par interface sans liquide additionnel (EC-ESI-SM). La méthodologie TDLFP (Transverse Diffusion of Laminar Flow Profile) a été utilisée comme méthode générique pour le mélange par diffusion hydrodynamique de nano-volumes de réactifs et de substrat dans le capillaire. Différentes approches (middle-up etbottom-up) ont été développées. Concernant l’approche middle-up, plusieurs microréacteurs ont été développés : (i) digestion enzymatique des mAbs par l’immunoglobulin-degrading enzyme from Streptococcus pyogenes (IdeS), (ii) réduction des ponts disulfures par le tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) et (iii) digestion enzymatique et réduction simultanées par l’IdeS et par le TCEP. Un microréacteur a également été développé pour l’approche bottom-up. Une étape de prétraitementde l’échantillon de mAb a été réalisée en combinant une étape de dénaturation par le surfactant RapiGest® et une étape de réduction par le dithiothreitol (DTT). La digestion in-line du mAb dénaturé-réduit a été réalisée par une trypsine modifiée résistante à l’autolyse. Les paramètres affectant les mélanges intracapillaires et le rendement des réactions ont été optimisés. Les méthodologies développées ont donné des résultats originaux et présentent plusieurs avantages par rapport aux méthodes de préparation d’échantillon off-line : automatisation, préconcentration, flexibilité par rapport aux conditions d’analyse (dénaturantes et non-dénaturantes), diminution de la consommation des réactifs et du temps d’analyse. Finalement, l’application des méthodologies développées à différents types de mAbs et un conjugué anticorps-médicament (ADC) a démontré leur versatilité et leur spécificité. Parallèlement, des méthodes de séparation ont été développées avec des électrolytes de fond dénaturants et non-dénaturants compatibles à la spectrométrie de masse. Un recouvrement neutre (oxyde de polyéthylène) a été utilisé pour éviter les phénomènes d’adsorption etavoir une résolution de séparation élevée. Les analyses de variants de mAbs intacts ainsi que des produits issus des différentes réactions ont été réalisées avec de grandes efficacités de séparation. Des analyses par EC-ESI-SM, MALDI-SM et nano ESI-SM ont été conduites pour identifier les produits des réactions (middle-up) et mettre en évidence les interactions non-covalentes entre les sous-unités des mAbs dans les conditions non-dénaturantes.