Résumé
P53 est un suppresseur de tumeur qui joue un rôle clé dans la régulation de la transcription, la réparation de l'ADN, l'instabilité génétique, la sénescence, la régulation du cycle cellulaire et l'apoptose. Cette protéine, normalement nucléaire, se lie à l’ADN et régule la transactivation. Cependant, elle est souvent mutée dans les tumeurs humaines, entraînant une inactivation fonctionnelle et une prédisposition au cancer. Les mutants p53 se peuvent-être de deux catégories des mutants de « contact » ou « conformationnel ». Ces derniers entraînant des changements de conformation pouvant induire une agrégation de la protéine de type amyloïde. Des études récentes ont montré que l’agrégation de p53 pouvait être efficacement reversée, rétablissant ainsi la fonction de p53 chez la souris. Les approches de diagnostic actuelles basées sur le séquençage génétique permettent d'identifier le statut mutationnel de p53, mais ne renseignent pas sur son statut conformationnel. Le but de ma thèse est de développer un biosenseur peptidique fluorescent qui reconnaît et rend compte des mutants conformationnels de p53 exprimés dans des cancers humains. Nous avons caractérisé et optimisé la réponse de ce biosenseur par conjugaison avec différentes sondes sensibles à l'environnement. Nous avons également étudié leur capacité à signaler de manière sélective le mutant R248Q de p53 in vitro à l’aide de formes recombinantes de protéines p53 de type sauvage et mutantes, ainsi que de lysats de lignées cellulaires de cancer du poumon exprimant p53 de type sauvage (A549), le mutant R248Q (PC9) ou p53 - / - (H1299). Après avoir établi les conditions de travail optimales et les limites du biocapteur in vitro, nous avons appliqué ce biosenseur à l’imagerie de cellules vivantes par microscopie à fluorescence, après avoir procédé à l’internalisation cellulaire facilitée par un peptide vecteur (ou CPP : Cell Penetrating Peptide) afin d’établir son potentiel pour de futures applications de diagnostic et thérapeutiques. Nous avons de plus vérifié la réponse du biosenseur à l'expression induite de mutants conformationnels de p53, ainsi qu'à sa régulation négative, à la fois in vitro et dans des cellules vivantes.