Abstract
Chez les plantes soumises à un excès de fer, l'induction des ferritines constitue la réponse moléculaire la mieux caractérisée. Ce processus est contrôlé par des étapes de (dé)phosphorylation de protéines. L'objectif de ce travail était de caractériser les variations du phosphoprotéome de cellules d'Arabidopsis cultivées dans différentes conditions de nutrition en fer pour révéler les acteurs moléculaires impliqués dans ces évènements précoces. L'essentiel de l'approche a été réalisé directement à partir des peptides. La stratégie générale a consisté à d'abord optimiser, sur des mélanges de protéines modèles de complexité croissante, des procédures de purification et de tri des peptides phosphorylés, puis à appliquer ces démarches aux situations biologiques d'intérêt. Dans chaque cas, l'identification des sites de phosphorylation a été réalisée par MS/MS, de type MALDI-TOF/TOF ou nanoLC-ESI. Parmi les méthodes développées, la combinaison d'un enrichissement initial par interaction avec du TiO2, d'un fractionnement par échange d'anion et d'une purification finale sur dioxyde de titane, s'est avérée la plus performante pour les mélanges complexes de phosphopeptides. Cette méthode a ensuite été appliquée aux peptides excisés de la face cytoplasmique de la membrane plasmique. Elle a permis d'identifier des sites pS et pT sur des peptides mono- et multi-phosphorylés de diverses protéines membranaires d'Arabidopsis. Parmi les phosphoprotéines identifiées, une partie majeure correspond à des transporteurs ou à des kinases, et un tiers des sites de phosphorylation n'avaient jamais été décrits. Diverses approches de marquage (métabolique, chimique, protéolytique) ont ensuite été adaptées pour quantifier les variations cinétiques de ces sites au cours de la réponse au stress. L'estimation des changements de niveaux de phosphorylation a été réalisé en spectrométrie de masse après fractionnement et enrichissement des peptides comme décrit ci-dessus.