Résumé
La microcine J25 (MccJ25) est un peptide antimicrobien de 21 acides aminés produit selon la voie ribosomiale et sécrété par une souche d'Escherichia coli. MccJ25 présente une structure très originale dite en lasso, impliquant un cycle lactame formé entre l'extrémité N-terminale et la chaîne latérale de l'acide glutamique en position 8, la région C-terminale étant piégée et fermement maintenue stériquement dans le cycle. De telles structures en lasso ont été décrites également pour quelques peptides naturels inhibiteurs d'enzymes, mais la voie de biosynthèse de tous ces peptides est inconnue. Le système génétique de MccJ25 est bien caractérisé. Il comporte un gène codant McjA, le précurseur de la microcine constitué de 58 acides aminés, un gène codant McjD, une protéine impliquée dans l'export de MccJ25 conférant à la souche productrice la résistance à MccJ25, et deux gènes codant McjB et McjC, deux protéines supposées être impliquées dans la maturation de McjA pour former la microcine active. Les recherches d'homologies ne permettent pas de prévoir la fonction de McjB et McjC, et par conséquent de proposer un mécanisme de maturation du précurseur McjA. Dans le but de caractériser la voie de biosynthèse de MccJ25, nous avons entrepris des expériences d'inactivation/complémentation des gènes mcjB et mcjC, qui ont montré que les deux protéines McjB et McjC sont requises pour la production de MccJ25 par la souche productrice. Parallèlement, les protéines recombinantes McjA, McjB et McjC munies d'une étiquette histidine ont été surexprimées puis purifiées afin de réaliser des expériences de reconstitution in vitro de la biosynthèse de MccJ25. La formation de MccJ25 a été détectée (i) par des tests d'activité antimicrobienne spécifique de MccJ25 et (ii) par couplage chromatographie liquide haute performance - spectrométrie de masse. Nous avons montré qu'in vitro, la protéine His6-McjA peut être convertie en MccJ25 sous l'action combinée de His6-McjB et His6-McjC, en présence d'ATP et de Mg2+. Ce résultat est la première reconstitution in vitro de la maturation d'un peptide en lasso et présente un intérêt biotechnologique important en terme de biosynthèse de peptides de structure complexe.