Résumé
CONTEXTE et ENJEUX :Ce projet a pour but l’élaboration et la validation d’un système de mesure en temps réel de l'étatmétabolique (physiologique et pathologique) des cellules musculaires, le but ultime étant de letransférer in vivo au muscle squelettique murin. Notre stratégie est d’analyser l’état d’activation desvoies signalétiques clefs pour la survie et la destinée des cellules musculaires en étudiant l'interactionde certains de leurs composants moléculaires par le développement de capteurs BRET(Bioluminescence Resonnance Energy Transfert). Une fois validés ces capteurs permettront dedéterminer in cellulo l'influence de stress environnementaux et de différents génotypes sur l'étatmétabolique du muscle en développement. Deux modèles de capteurs « prédictifs » du musclesquelettique ont été développés; 1) le capteur 4EBP1/EIF4E qui mesure l’activation de la voieIGF-1/AKT/mTOR : Cette voie constitue la voie majeure de régulation de la croissance et de la surviedu muscle squelettique. La détermination de son état d'activation repose sur l’analyse del’interaction/dissociation entre les protéines 4EBP1/EIF4E, verrou ultime de l’initiation de la traductiondes mARNs (et donc de la synthèse protéique). 2) Le capteur mitofusines pour évaluer l'intégrité desmitochondries musculaires : La biogenèse et le métabolisme mitochondrial reposent sur un équilibreentre fusion et fission de ces organites qui conditionne in fine la survie cellulaire. L'hétérodimerisationdes protéines mitofusines Mfn1 et Mfn2 localisées à la surface externe des mitochondries contrôle cecycle de fusion/fission.RESULTATS1) Les différents plasmides nécessaires au projet ont été construits et les expériences de BRET ontdémontré la faisabilité de l’approche pour détecter l’interaction en temps réel dans des cellulesvivantes d’une part entre les Mitofusines d’autre part entre 4EBP1 et EIF4E.2) La fonctionnalité du complexe 4EBP1/EIF4E a été vérifiée in vitro en démontrant l’interaction desprotéines exogènes avec la coiffe 5’ des mRNAs (par immunoprécipitation sur billes de methyl-7GTP-Sepharose).3) Comme attendu nous avons observé par une approche biochimique que l’interaction entre 4EBP1 etEIF4E mesurée par BRET dépend du niveau de phosphorylation de 4EBP1 (et donc de l’activation dela voie mTORC1). En effet l’introduction de mutations mimant les formes phosphorylées de 4EBP1entraîne une diminution de l’affinité entre 4EBP1 et EIF4E. Réciproquement, des mutants de 4EBP1résistants à la phosphorylation par TORC1 ont une affinité accrue pour la protéine EIF4E.4) La surexpression d’un inhibiteur de la voie mTORC1 (Redd1) augmente l’affinité entre 4EBP1 etEIF4E suggérant que le capteur 4EBP1/EIF4E est bien sensible à l’état d’activation de la voiemTORC1.5) En collaboration avec Julie Perroy (IGF CNRS Montpellier) nous avons déterminé par imagerie lalocalisation in cellulo du BRET mesuré et nous observons qu’une part de l’interaction entre lesmitofusines est bien localisée au niveau de la surface mitochondriale et d’autre part que celle ducomplexe 4EBP1/EIF4E s’effectue principalement au niveau du compartiment nucléaire.