Abstract
Balan Lab (F1) O 2 CO 2 the WILD … Free to go everywhere Born and grown in … … a LABORATORY small cage / unlimited food / limited mobility Outbred laboratory strain Lab-bred offspring House mice (Mus musculus domesticus) trapped in a horse stable N =18 N =12-18 N =12-14 Inner ear disparity Take Home Message Swiss ≠ ≠ ≠ ≠ ≠ Wild/lab Balan →≠ genetic background →>100 years of lab breeding Séquençage de mitogénomes avec l'approche Oxford Nanopore AAP Recherche 2018 Pascale CHEVRET Corinne REGIS Jérôme BRIOLAY Christine OGER MinION (Oxford Nanopore) Extraction d'ADN + dosage PCR1 Purification/billes mag. Quantification (Qubit) PCR2 (tags) Purification/billes Quantification (Qubit) Normalisation Pool ADN contrôle End-repair + dA-tailing Ligation des adaptateurs Purification/billes Purification/billes Loading beads Dépôt sur flow cell FLO-MIN 106 (R 9.4) Projet FR Séquençage de mitogénomes Amplification de 2 amplicons chevauchants amplifiés par Long-Range PCR Séquençage avec l'approche Oxford Nanopore Comparaison Séquençage (méthode Sanger) d'un gène mitochondrial (D-loop) 10 kb A1 B1 C1 E1 F1 G1 H1 D1 A2 B2 C2 E2 F2 G2 H2 D2 9.6 kb fragment F2 Long-Range-PCR du fragment F2: 6h30 Premiers essais sur Myodes glareolus (Filipi et al., 2015) Différentes extractions (plus ou moins anciennes) Différents kits (Qiagen et Macherey-Nagel) → Pas/peu d'amplification, problème de qualité d'ADN Choix d'un autre taxon, Mus musculus (Lee et al., 2017) Extraction d'ADN de souris de différentes origines géographiques Kit Nucleospin DNA RapidLyse (Macherey-Nagel) La phylogéographie utilise généralement des séquences d'un ou deux gènes mitochondriaux pour reconstituer l'histoire récente des lignées génétiques au niveau intra-spécifique.</p><p>Ce type de marqueurs pose deux problèmes :</p><p>1) leur faible taille (en général < 1kb) limite la résolution des phylogénies obtenues 2) la présence dans de nombreux cas de copies nucléaires (numt) qui vont venir perturber les patrons de diversité génétique et les reconstructions phylogéographiques (Dubey et al., 2009, Haran et al., 2015) Différentes approches possibles pour éviter les numt -Définition d'amorces spécifiques -Extraction sélective d'ADN mitochondrial -PCR long range et séquençage Sanger ou approches NGS (GS Junior System, Illumina, Oxford Nanopore) Remerciements : Le Centre de Calcul IN2P3 pour l'utilisation des GPU pour le basecalling L'animalerie ACSED pour les souris de Balan et leurs descendants, qui avaient été piégées et élevées dans le cadre d'un projet financé par l'AAP FR 2017, et les souris swiss.