Résumé
Les travaux sur la mise au point de la transformation génétique chez l'hévéa ont démarré au Cirad en 1995. Le système de transfert de gène par Agrobacterium tumefaciens a été choisi pour la transformation de cellules de téguments de graine et de cals friables en prolifération qui offrent deux voies de régénération de plantes par embryogenèse somatique. L'induction de la callogenèse s'était révélée être un facteur très favorable à la transformation des téguments. Cette année, le problème de croissance des agrobactéries sur les téguments après la phase de coculture, représentait la limite majeure à la poursuite du processus. L'introduction d'une phase de lavage puis de sèchage drastique des téguments cocultivés avec les agrobactéries a permis l'obtention de cals transgéniques a plusieurs reprises. Par la suite, nos efforts devront donc porter sur l'utilisation de clones très réactifs en terme d'embryogenèse et l'établissement d'une phase de sélection de cellules transformées afin de conduire à la production d'embryons transgéniques. La transformation de cals friables était jusqu'à présent obtenue de façon aléatoire. L'expression du gène rapporteur GUS était très faible. Un fort brunissement des cultures apparaissait après quelques jours de culture ne permettant pas une prolifération des cellules transformées. Une phase de préculture des cals friables pendant 2 semaines sur différents milieux a été étudiée avant l'inoculation des cals avec les agrobactéries. L'utilisation d'un milieu de prolifération appauvri en calcium a fortement stimulé l'activité GUS enregistrée une semaine après la phase de coculture. Ce résultat majeur va permettre d'optimiser la phase d'inoculation et de coculture avec les agrobactéries, puis d'élaborer une phase de décontamination efficace afin de lutter contre la reprise de croissance des bactéries et le brunissement des cals. Parallèlement, des analyses moléculaires de type Northern ont montré que les gènes codant pour plusieurs isoformes de la glutamine synthétase, dont la GS1 qui est induite dans le latex d'arbres stimulés à I'éthrel, ainsi que l'hévéine qui est spécifique du latex, sont exprimés dans les cals friables en prolifération. Cela pourrait être expliqué par le fait que les cals friables en prolifération sont composés en grande partie de cellules dont le contenu cytoplasmique est riche en protéines. A ce stade appelé méristématique où les cellules sont totipotentes, un grand nombre de gènes doit être exprimé. Ces expressions de la GS1 et de l'Hévéine dans les cals, nous permettent de supposer que nous pouvons utiliser ce matériel pour étudier la fonctionalité des promoteurs correspondants clonés par Pujade-Renaud. Des cals friables seront donc transformés avec des constructions moléculaires permettant de tester cette fonctionalité par étude en expression transitoire du gène rapporteur GUS dirigé respectivement par les 2 promoteurs GS1 et Hey. Enfin, nous envisageons des études cytologiques en liaison avec le laboratoire Biotrop. Ces études ont pour but de mieux caractériser les types cellulaires d'une part favorable à la transformation, et d'autre part ceux exprimant les gènes dont nous voulons étudier l'expression via l'étude de leurs promoteurs. Le développement des outils d'hybridation in situ sera une phase complémentaire à cette approche "étude de l'expression des gènes liés à la production de latex". (Résumé d'auteur)