Résumé
Les cellules eucaryotes possèdent toutes un système de transport intra-cellulaire leur permettant d'assurer de nombreuses fonctions liées à leur intégrité et à leur capacité à communiquer avec le milieu extérieur. Nous pouvons citer la capture de molécules présentes dans le milieu extra-cellulaire, la régulation de la quantité de récepteurs transmembranaires présents à la surface de la cellule ou encore la communication entre les divers compartiments présents au sein des cellules. Cette thèse traite plus particulièrement de la voie d'endocytose / recyclage, dépendante de la petite GTPase Rab11a. Cette voie de transport et ses acteurs moléculaires sont canoniquement étudiés à l'aide du Récepteur à la Transferine (RtF), un marqueur protéique transmembranaire. Nous l'avons utilisé ici au titre de référence vis-à-vis d'une autre molécule cargo, une Lectine de type C exprimée naturellement et exclusivement par les cellules de Langerhans de l'épidémie, la Langerine, dont la stabilité et la distribution cellulaire dépendent strictement de la présence de Rab1 la fonctionnelle, à l'inverse du Récepteur à la Transferrine. Une grande partie de cette thèse est basée sur l'analyse de données dynamiques. L'analyse spatio-temporelle de ces dynamiques et leurs comparaisons ont nécessité la mise au point de protocoles standardisés d'acquisition d'images en cellule unique (micro-patrons, microscopie à ondes évanescentes en double couleur ultra-rapide) et la génération d'une chaîne de traitement des données (PBED, algorithme de classification, plugin image J de visualisation, procédure de normalisation). L'analyse et la comparaison de la dynamique des dernières étapes du recyclage de ces deux molécules cargos (le récepteur à la Transferrine et la Langerine) à la membrane plasmique, nous a permis de disséquer le rôle et les sites d'action des plates-formes multimoléculaires organisées autour de Rab11a (Rab11a, Rab1lFIP2, MyoVb...), ainsi que l'impact de formes mutantes de leurs constituants, avec une appréciation statistique et temporelle. Dans ce modèle, nous avons ainsi pu déterminer le temps de mise en place du complexe d'exocytose permettant la fusion de la vésicule à la membrane plasmique, le rôle d'organisateur de membranes pour de telles protéines par les différences mesurées de comportements de recyclage de la Langerine et vis-à-vis du recyclage du RTf. En collaboration avec le synchrotron Soleil, une partie de cette thèse a été consacrée à l'élaboration d'une sonde multi-modale permettant l'étude corrélative de la dynamique de la Langerine et la biogénèse des Granules de Birbeck par l'utilisation de vidéo-microscopies de fluorescence, de la microscopie électronique et de la microscopie rayons X mous. Des premiers résultats et quelques perspectives sont présentés.
Eukaryotic cells have intra-cellular transport System to insure numerous functions linked to their integrity and ability to communicate with the extracellular medium. We can list the capture of extracellular molecules, regulation on transmembrane protein localized at the cell surface or communication between different intra cellular compartments. The thesis treats about the recycling and endocytic pathways dependent of the small GTPase Rab11a. This way is commonly studied with the help of the Transferrin Receptor protein (TfR), a transmembrane cargo protein. We used as a reference against another protein, a C-lectin naturally and exclusively expressed by epidermic Langerhans cells. Stability any Distribution of Langerin is strictly dependent of Rab1 1a. That is not the case for TfR. The greater part of this thesis is based on dynamic data analysis. Spatio-temporal analysis of these dynamics and their comparison has asked the build of standardized and automatized protocols (micro-patterning, ultra-fast TIRFm) and generation of process to treat data (PBED, classification algorithm, image J plugin for visualization, normalization procedure). Analysis and comparison of the dynamics for the last steps of recycling for Langerine and TfR to the plasma membrane give us the opportunity to decipher the roles and action sites of multi-molecular platforms around Rab11a (Rablla,RabllFIP2, MyosinVb) and so the impact of mutated forms of their constituents with great sensitivity to temporal and statistical features. In this model we were able to determinate the time to settle the exocytosis complex allowing vesicles fusion at the plasma membrane the membrane organizer role for such proteins by different measured behaviors of Langerine comparing to TfR. With Soleil synchrotron, the second part of this thesis have been done to elaborate a multi-modal probe allowing the correlative study of Langerine dynamics and Birbeck granules biogenesis by the use of fluorescence microscopies, TEM and Soft X Rays microscopy. First results and perspective are presented.